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?中瑞祥解析活性氧測(cè)定儀的使用步驟

活性氧測(cè)定儀 使用原理?主要基于熒光探針 DCFH-DA （2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯）的氧化反應(yīng)。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH（2',7'-二氯二氫熒光素）。DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而被細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）氧化生成有綠色熒光的DCF（二氯熒光素）。DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS的水平成正比，因此可以通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平?

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活性氧測(cè)定儀的使用步驟

?裝載探針?：對(duì)于刺激時(shí)間較短的細(xì)胞（通常為2小時(shí)內(nèi)），先裝載探針后再進(jìn)行刺激；對(duì)于刺激時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞（通常為6小時(shí)以上），先進(jìn)行刺激后再裝載探針。

?細(xì)胞準(zhǔn)備?：檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于5×10^5/mL。

?藥物誘導(dǎo)?：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類型決定。

?陽(yáng)性對(duì)照?：可選步驟，先用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照（如Rosup）到常用工作濃度，加入細(xì)胞中孵育30分鐘至4小時(shí)，以提高活性氧水平。

?探針裝載?：吸除處理藥物，加入稀釋好的DCFH-DA工作液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30分鐘。

?細(xì)胞清洗?：用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。

?熒光檢測(cè)?：使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀等設(shè)備，在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm附近檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度?

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活性氧測(cè)定儀的應(yīng)用領(lǐng)域和重要性

活性氧（ROS）在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡等生理和病理過(guò)程中起著重要作用。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，可以了解細(xì)胞在不同條件下的氧化應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)于研究疾病機(jī)制、藥物毒性評(píng)估以及開(kāi)發(fā)新的治療方法具有重要意義。此外，活性氧測(cè)定儀還廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全等領(lǐng)域?